技術領域
[0001] 本發明涉及多糖特別是透明質酸或其鹽的噴霧干燥。
背景技術

[0002] 透明質酸（HA）是一種天然的線性碳水化合物聚合物，屬于非硫酸化糖胺聚糖類。其由β-1,3-N-乙酰葡糖胺和β-1,4-葡糖醛酸重復二糖單元組成，分子量（MW）達10MDa。

申請日：2012-05-29
申請人： 諾維信生物制藥丹麥公司
發明人 ： K.特梅拉斯 , P.巴赫
IPC分類號： C08B37/00 , B01D1/18 , C08L5/08
CPC分類號： A61K31/728 , C08B37/0072 , C08L5/08

HA見于透明軟骨、滑膜關節液和皮膚組織包括表皮和真皮層。
[0003] HA可提取自天然組織，包括脊椎動物的結締組織、人臍帶和雞冠。然而，現今優選通過微生物方法制備透明質酸，從而使傳播傳染性病原體的潛在風險最小化，并提升產品一致性、質量和可得性（US6,951,743）。
[0004] 已鑒定HA在人體中的多種作用。它在生物有機體中發揮著重要作用，作為很多組織（如皮膚、腱、肌肉和軟骨）的細胞的機械支撐。HA參與關鍵生物過程，如組織潤燥（moistening of tissue）以及潤滑。還猜測它在眾多生理功能如粘附、細胞運動、癌癥、血管發生和傷口愈合中發揮作用。
[0005] 由于HA獨特的物理和生物性質（包括粘彈性、生物相容性和生物可降解性），HA在大范圍的化妝品、眼科學、風濕病學、藥物和基因傳遞、傷口愈合和組織工程學的當前和開發應用中得以采用。
[0006] WO05/116531描述了一種噴霧干燥透明質酸的方法（分子量為800kDa-參見實施例6）。
[0007] 在對分子量比約1200kDa更高的透明質酸進行噴霧干燥時，可能出現明顯的分子量損失。
發明內容
[0008] 本發明涉及對高分子量透明質酸進行噴霧干燥的方法。該方法包括：
[0009] a）將透明質酸噴霧干燥，其中噴霧干燥器進料中的透明質酸的濃度在3.5g/l至7.0g/l的范圍內；
[0010] b）使噴霧干燥器進料的溫度在0℃至100℃的范圍內；且，
[0011] 其中噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量≥1200kDa。
[0012] 本發明的方法降低了經噴霧干燥的透明質酸產品的分子量損失。
具體實施方式
[0013] 本發明涉及對高分子量透明質酸進行噴霧干燥的方法。
[0014] 透明質酸
[0015] “透明質酸”是一種多糖，在本文中定義為由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）及葡糖醛酸（GlcUA）的重復二糖單元組成的非硫酸化糖胺聚糖，其通過交替的β-1,4和β-1,3糖苷鍵連接在一起。透明質酸也被稱作透明質烷（hyaluronan）、透明質酸鹽（hyaluronate）或HA。術語透明質烷和透明質酸在本文中可以互換使用。
[0016] 雞冠是透明質烷的重要商業來源。微生物是另外可選的來源。美國專利第4,801,539號公開了一種制備透明質酸的發酵方法，其包含獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）的菌株。WO03/054163公開了一種制備透明質酸的發酵方法，其包含芽孢桿菌（Bacillus）宿主。
[0017] 透明質烷合酶被描述為來自脊椎動物、細菌病原體和藻類病毒（DeAngelis,P.L.,1999,Cell.Mol.Life Sci.56:670-682）。WO99/23227公 開 了 來 自 似 馬 鏈 球 菌（Streptococcus equisimilis）的I組透明質酸鹽合酶。WO99/51265和WO00/27437描述了來自多殺性巴氏桿菌（Pasturella multocida）的II組透明質酸鹽合酶。Ferretti等人公開了釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的透明質烷合酶操縱子，其由三個基因hasA、hasB和hasC組成，分別編碼透明質酸鹽合酶、UDP葡萄糖脫氫酶和UDP葡萄糖焦磷酸化酶，（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98,4658-4663,2001）。WO99/51265描述了具有似馬鏈球菌透明質烷合酶的編碼區的核酸片段。
[0018] 由于重組芽孢桿菌細胞的透明質烷直接表達至培養基中，可使用簡單的方法從培養基中分離透明質烷。首先，從培養基中物理去除芽孢桿菌細胞和細胞碎片。如果期望，首先可將培養基稀釋，以降低培養基的粘性。用于從培養基去除細胞的許多方法對于本領域技術人員是已知的，例如離心和微濾（microfiltration）。如果期望，然后可將剩余的上清液過濾，例如通過超濾，以濃縮透明質烷并從中去除小分子污染物。去除細胞和細胞碎片之后，通過已知機制從培養基簡單沉淀透明質烷。鹽、醇或鹽和醇的組合可用于從濾液沉淀透明質烷。
[0019] 可以通過使用例如本發明的噴霧干燥法從任何溶液干燥透明質烷，例如從濾液或從再溶解的溶液中干燥透明質烷。
[0020] 宿主細胞
[0021] 優選的實施方式涉及第一方面的產品，其中以重組方式生產透明質酸或其鹽，優選通過革蘭氏陽性細菌或宿主細胞生產，更優選通過芽孢桿菌屬的細菌生產。
[0022] 宿主細胞可以是任何適合于透明質酸重組生產的芽孢桿菌細胞。芽孢桿菌宿主細胞可以是野生型芽孢桿菌細胞或其突變體。可在本發明的實踐中使用的芽孢桿菌細胞包括但不限于，Bacillus agaraderhens、嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alkalophilus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、短芽孢桿菌（Bacillus brevis）、環狀芽胞桿菌（Bacillus circulans）、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus）、燦爛芽胞桿菌（Bacillus lautus）、遲緩芽孢桿菌（Bacillus lentus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）細胞。WO98/22598中記載了特別適于重組表達的突變枯草芽孢桿菌細胞。無被囊的（non-encapsulating）芽孢桿菌屬細胞在本發明中是特別有用的。
[0023] 在優選實施方式中，芽孢桿菌屬宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。
[0024] 生產
[0025] 在本發明的方法中，使用本領域已知的方法在適合于生產透明質酸的營養培養基中培養細胞（如鏈球菌屬）或宿主細胞（如芽孢桿菌屬）。
[0026] 例如，可在實驗室或工業發酵罐中通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵（包括連續發酵、分批發酵、分批補料發酵或固態發酵）來培養細胞。
[0027] 使用本領域已知的步驟在包含碳源、氮源和無機鹽的合適營養培養基中進行培養。合適的培養基可以從商業供應商獲得，或可以根據已公開的組成（例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中）制備。
[0028] 可以按本領域已知的，例如使用改進的咔唑方法（Bitter and Muir,1962,Anal Biochem.4:330-334），來測定透明質酸的水平。
[0029] 分子量
[0030] 可以按本領域已知的來測定透明質酸的平均分子量。
[0031] 特別地，可以使用本領域的標準方法測定透明質酸的平均分子量，例如由Ueno等 ,1988,Chem.Pharm.Bull.36,4971-4975;Wyatt,1993,Anal.Chim.Acta272:1-40； 和Wyatt Technologies,1999,“Light Scattering University DAWN Course Manual”和“DAWN EOS Manual”Wyatt Technology Corporation,Santa Barbara,California所描述的那些方法。
[0032] 透明質酸的分子量測定也可采用GPC-RI-LS進行，其中透明質酸的分子量測定采用GPC聯用示差RI和多角度光散射檢測器進行。
[0033] 在優選的實施方式中，噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量為至少1200kDa；特別地，噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至10,000kDa的范圍內；優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至9,500kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至9,000kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至8,500kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至8,000kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至7,500kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在
1200kDa至7,000kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至6,500kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至
6,000kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至5,500kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至5,000kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至4,500kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至4,000kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至3,500kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至3,000kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至2,900kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至2,800kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在
1200kDa至2,700kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至2,600kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至
2,500kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至2,400kDa的范圍內；更優選噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至2,300kDa的范圍內；特別地，噴霧干燥器進料中的透明質酸的分子量在1200kDa至2,200kDa的范圍內。
[0034] 在優選的實施方式中，噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于15%；例如，噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于14%；噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于13%；噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于12%；噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于11%；噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于10%；噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于9%；噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于8%；噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于7%；噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于6%；特別地，噴霧干燥過程中透明質酸的分子量損失低于5%。
[0035] HA鹽
[0036] 優選的實施方式涉及包括透明質酸的鹽的產品；特別是包含透明質酸的無機鹽的產品；優選包括透明質酸鈉、透明質酸鉀、透明質酸銨、透明質酸鈣、透明質酸鎂、透明質酸鋅或透明質酸鈷的產品。
[0037] 衍生化的HA
[0038] 根據本發明進行噴霧干燥的透明質酸可以如本領域已知的進行衍生化或修飾。
[0039] HA可以以多種不同方式進行衍生化或修飾，例如，如在WO2007/033677中所描述的，其中透明質酸（HA）可與芳基或烷基琥珀酸酐（ASA）反應，產生包括n個重復單元且在pH8-9下具有結構通式（I）的芳基/烷基琥珀酸酐HA衍生物：
[0040]
[0041] 其中在至少一個重復單元中，R1、R2、R3、R4中的一個或多個包括在pH8-9下具有結構通式（II）的酯鍵合的烷基/芳基琥珀酸，否則R1、R2、R3、R4為羥基OH：
[0042]
[0043] 其中R5、R6、R7、R8中的至少一個包括烷基或芳基，否則R5、R6、R7、R8是氫原子H，其中標記“酯”的氧參與與結構（I）形成的酯鍵。
[0044] 可以如WO2007/106738中所記載的對HA進行衍生化或修飾，其中按以下方式制備丙烯酸酯化（acrylated）的透明質酸：
[0045] （a）制備包含透明質酸的pH為7～11的水性液體；
[0046] （b）制備包含丙烯酰氯和二氯甲烷/乙醚的有機液；和
[0047] （c）將（b）的有機液與（a）的水性液體混合，其中pH維持在7～11。
[0048] 丙烯酸酯化的透明質酸產物具有以下結構：
[0049]
[0050] 其中R1選自氫、甲基、氯和COCl，R2選自氫、甲基、苯基、氯、2-氯苯基、COCl和CH2COCl，R3選自氫、甲基、氯、4-硝基苯基、3-三氟甲基苯基和苯乙烯基部分。
[0051] 噴霧干燥器進料
[0052] 噴霧干燥器進料中的透明質酸的濃度應在3.5g/l～7.0g/l的范圍內；例如，在3.6g/l～7.0g/l的范圍內；在3.7g/l～7.0g/l的范圍內；在3.8g/l～7.0g/l的范圍內；在3.9g/l～7.0g/l的范圍內；在4.0g/l～7.0g/l的范圍內；在4.0g/l～6.9g/l的范圍內；在4.0g/l～6.8g/l的范圍內；在4.0g/l～6.7g/l的范圍內；在4.0g/l～6.6g/l的范圍內；在4.0g/l～6.5g/l的范圍內；在4.0g/l～6.4g/l的范圍內；在4.0g/l～
6.3g/l的范圍內；在4.0g/l～6.2g/l的范圍內；在4.0g/l～6.1g/l的范圍內；特別地，在4.0g/l～6.0g/l的范圍內。
[0053] 其他成分
[0054] 在根據本發明的一個實施方式中，包含透明質酸的進料還可包含其他成分，例如活性成分和/或賦形劑。
[0055] 可用于本發明的活性成分或藥理學活性物質的非限制性實例包括蛋白質和/或肽藥物。
[0056] 蛋白質和/或肽藥物的實例為，人生長激素、牛生長激素、豬生長激素、生長激素釋放激素/肽、粒細胞-集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子、巨噬細胞-集落刺激因子、紅細胞生成素、骨形態發生蛋白、干擾素或其衍生物、胰島素或其衍生物、心房肽激素III（atriopeptin-III）、單克隆抗體、腫瘤壞死因子、巨噬細胞活化因子、白介素、腫瘤變性因子（tumor degenerating factor）、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、組織纖溶酶原激活物、因子IIV、因子IIIV和尿激酶。
[0057] 根據本發明可以例如出于穩定活性成分的目的包括賦形劑，這些賦形劑可包括蛋白質，例如白蛋白或明膠；氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸及其鹽；碳水化合物如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇、山梨糖醇、海藻糖和硫酸軟骨素；無機鹽如磷酸鹽；表面活性劑如 （ICI）、聚乙二醇及其混合物。
[0058] 噴霧干燥
[0059] 噴霧干燥涉及將液體進料霧化成液滴噴霧以及在干燥室中使液滴與熱空氣接觸。通過旋轉（輪）霧化器或噴嘴霧化器產生噴霧。
[0060] 根據霧化原理，液滴大小通常在10～100微米的范圍內。有兩種主要類型的噴嘴：高壓單流體噴嘴（50～500巴）和雙流體噴嘴：第一流體是要干燥的液體，第二流體是壓縮氣體（一般是2～7巴的空氣）。
[0061] 從液滴蒸發水分并形成干燥顆粒在受控的溫度和氣流條件下進行。粉末不斷從干燥室排出。根據目標產品的干燥特性來選擇操作條件。
[0062] 根據本發明，可以使用本領域已知的任何噴霧干燥器，但在本方法的一個實施方式中，使用雙流體噴嘴（TFN）或旋轉式霧化器進行噴霧干燥步驟。
[0063] 可使用100℃至200℃的進口溫度進行噴霧干燥；優選120℃至200℃的進口溫度；特別是140℃至200℃的進口溫度。
[0064] 可使用40℃至95℃的出口溫度進行噴霧干燥；優選50℃至94℃的出口溫度；優選60℃至94℃的出口溫度；特別是70℃至93℃的出口溫度。
[0065] 可使用0℃至100℃的進料溫度進行噴霧干燥；例如1℃至100℃的進料溫度；2℃至100℃的進料溫度；3℃至100℃的進料溫度；4℃至100℃的進料溫度；5℃至100℃的進料溫度；6℃至100℃的進料溫度；7℃至100℃的進料溫度；8℃至100℃的進料溫度；9℃至100℃的進料溫度；10℃至100℃的進料溫度；11℃至100℃的進料溫度；12℃至100℃的進料溫度；13℃至100℃的進料溫度；14℃至100℃的進料溫度；15℃至100℃的進料溫度；16℃至100℃的進料溫度；17℃至100℃的進料溫度；18℃至100℃的進料溫度；19℃至100℃的進料溫度；20℃至100℃的進料溫度；21℃至100℃的進料溫度；22℃至100℃的進料溫度；23℃至100℃的進料溫度；24℃至100℃的進料溫度；25℃至100℃的進料溫度；26℃至100℃的進料溫度；27℃至100℃的進料溫度；28℃至100℃的進料溫度；29℃至100℃的進料溫度；30℃至100℃的進料溫度；31℃至100℃的進料溫度；32℃至100℃的進料溫度；33℃至100℃的進料溫度；34℃至100℃的進料溫度；35℃至100℃的進料溫度；36℃至100℃的進料溫度；37℃至100℃的進料溫度；38℃至100℃的進料溫度；39℃至100℃的進料溫度；40℃至100℃的進料溫度；41℃至100℃的進料溫度；42℃至100℃的進料溫度；43℃至100℃的進料溫度；44℃至100℃的進料溫度；45℃至100℃的進料溫度；46℃至100℃的進料溫度；47℃至100℃的進料溫度；48℃至100℃的進料溫度；49℃至100℃的進料溫度；50℃至100℃的進料溫度；51℃至100℃的進料溫度；52℃至100℃的進料溫度；53℃至100℃的進料溫度；54℃至100℃的進料溫度；55℃至100℃的進料溫度；56℃至100℃的進料溫度；57℃至100℃的進料溫度；58℃至100℃的進料溫度；59℃至100℃的進料溫度；60℃至100℃的進料溫度；61℃至100℃的進料溫度；62℃至100℃的進料溫度；63℃至100℃的進料溫度；64℃至100℃的進料溫度；65℃至100℃的進料溫度；66℃至100℃的進料溫度；67℃至100℃的進料溫度；68℃至100℃的進料溫度；69℃至100℃的進料溫度；70℃至100℃的進料溫度；特別是70℃至99℃的進料溫度。
[0066] 噴嘴空氣溫度通常會在10℃至100℃；特別是在20℃至90℃。
[0067] 旋轉式霧化器的圓周速度通常會在50m/s至250m/s。
[0068] 根據本發明，可便利地通過噴霧干燥先產生干燥細粉。然后可在流化床和液體粘合劑中將所述細粉液化，例如將水噴到設備上形成附聚物。
[0069] 實施例
[0070] 實施例1
[0071] 使用進料中透明質酸（HA）濃度、進料溫度及霧化原理的不同組合進行噴霧干燥。
[0072] 以HA濃度、進料溫度和霧化原理（外部TFN或旋轉式霧化器）的不同組合在小中試規模噴霧干燥器（Minor pilot scale spray dryer，MM）中來運行HA。所有實驗均在GEA移動型小中試規模噴霧干燥器（MM）上進行。
[0073] 測量以下參數：送至噴霧干燥器的進料中的HA分子量（MW），產品中的HA分子量以及粒徑分布（PSD）。
[0074] 所有實驗均以195℃的干燥室進口溫度（Tin）、85℃的出口溫度（Tout）和約80kg/h的干燥氣流進行。
[0075] 表1總結了霧化原理為旋轉噴霧的結果，表2總結了霧化原理為TFN的結果。
[0076] 表1.
[0077]
[0078] 表2.
[0079]
[0080] 產品無一表現出任何變色。
[0081] 對表1和表2結果的統計分析表明，使用較高的進料HA濃度使噴霧干燥過程中的分子量損失明顯降低。
[0082] 實施例2
[0083] 對不同分子量的透明質酸進行噴霧干燥
[0084] 在裝備有外部雙流體噴嘴（TFN）的中試規模流化噴霧干燥器（FSD）上對不同批次的具有不同HA分子量（MW）和濃度的透明質酸（HA）的進料進行噴霧干燥。
[0085] 表3概述了進料濃度、HA分子量和干燥產品的HA分子量。
[0086] 所有批次以195℃的干燥室進口溫度、89℃的空氣出口溫度和95℃的進料溫度進行噴霧干燥。
[0087] 產品無一表現出任何變色。
[0088] 表3.
[0089]
[0090] 實施例3
[0091] 使用進料中透明質酸（HA）濃度、進料溫度及霧化原理的不同組合進行噴霧干燥。
[0092] 以HA濃度、進料溫度和霧化原理（外部TFN或旋轉式霧化器）的不同組合在小中試規模噴霧干燥器中來運行HA。所有實驗均在GEA移動型小中試規模噴霧干燥器（MM）上進行。
[0093] 測量以下參數：進料中的HA分子量（MW），產品中的HA分子量以及粒徑分布（PSD）。
[0094] 所有實驗均以195℃的干燥室進口溫度（Tin）、90℃的出口溫度（Tout）和約80kg/h的干燥氣流進行。
[0095] 表4總結了該結果：